Scienceshow/Vejledninger/DNA ekstraktion

Formål

Isolering af DNA fra løg

Nedenstående vejledning er en bearbejdning af: Dean Madden og John Scollar, 1993: "DNA your onions?", Practical Biotechnology, p. 30-31, NCBE.

Isolering af DNA fra celler er første trin i mange molekylærbiologiske undersøgelser. Nedenstående fremgangsmåde er en meget generel metode, der kan anvendes på mange celletyper, der indeholder en vis mængde DNA. Princippet i metoden er, at man først mekanisk nedbryder vævet, derefter nedbryder man eventuelle cellevægge, cellemembraner og kernemembraner med et detergent (vaskemiddel). Cellefragmenter adskilles ved filtrering. DNA og opløselige proteiner forbliver i den frafiltrerede væske. Til sidst udfældes DNA i iskold ethanol.

Sikkerhed

Sikkerhedsklasse

• Uskadelig (farligste elementer er alkohol og en blender)

Påkrævet sikkerhedsudstyr

Showfolk: Briller/kittel/grydelapper Tilhørere: -

Sikkerhedsmomenter

1. Forsigtighed ved udskæring af løg. Pas på fingrene, løg kan være glatte! Det er bedst at bruge en skarp kniv, som ikke smutter så nemt.
2. 60 ºC varmt vand er varmt, brug grydelapper.

Kemikaliedeklaration

1. Løg, NaCl og opvaskemiddel er husholdningskemikalier som ikke er farlige (dog må opvaskemiddel ikke spises el. lign.). Undgå at røre ved øjnene med løg på fingrene. Vask/skyl fingre efter berøring af alle tre ingredienser.
2. Ethanol er yderst brandfarligt. Hold al form for ild langt væk! 96 % ethanol er et organisk opløsningsmiddel som er skadeligt for alle kroppens celler, og indtag er derfor giftigt og kan medføre tab af hjerneceller, organsvigt og infertilitet (tænk på det næste gang du er i byen). I de små mængder man benytter her, kræves ikke andre specielle foranstaltninger end at der skal låg på flasken straks efter brug. Det er bedst at hælde fra en mindre flaske, som man kan håndtere ordentlig og derved undgå spild. Ethanol kan optages gennem huden og gennem indånding, derfor skal man arbejde i stinkskab og bære gummihandsker, hvis man arbejder med større mængder (f.eks. under forberedelse – ophældning i mindre flaske). Ethanol udtørrer endvidere huden.
3. DNA er uskadeligt at røre ved.
4. Acetoorcein/Giemsa er ufarligt i de mængder anvendes her, selvom det naturligvis ikke skal indtages. Dog bør objektglasset pakkes omhyggeligt ind eller smides ud i beholder beregnet til glasaffald, for at undgå ulykker med skarpt glas.

Affaldshåndtering

Alt kan bortskaffes i almindelig dagrenovation/håndvask efter eksperimentet. Objektglas anvendt ved evt. mikroskopering o. lign. skal pakkes omhyggeligt ind før det smides ud.

Materialer

Til at fremstille løgekstrakt:

• 100 g løg (brug et stort løg)
• 3 g NaCl (bordsalt)
• 100 ml destilleret vand
• 10 ml opvaskemiddel (af den billige ikke-koncentrerede slags)
• Spatel el. lignende til at røre i blandingen med
• Grønsagskniv og spækbræt
• (Blender)
• Kaffefilter
• Bægerglas

Evt. også:

• Vandbad, 60 °C (f.eks. gryde med ildfast skål)
• Termometer
• Isbad

Til at oprense og udfælde DNA:

• 6 ml løg-ekstrakt
• Reagensglas/højt glas
• 6 ml iskold 96 % ethanol

Note: Det er vigtigt at anvende 96% alkohol. Placer alkoholen i fryseren et døgn før forsøget. Alkoholen skal først tages ud lige før den skal bruges. Man kan også køle den i lidt flydende kvælstof, hvis man har det ved hånden, men undgå at køle lavere end -30 °C.

• Evt. Proteinase K 20 mg/ml

Evt. også:

• 1 Eppendorfrør
• Glasspatel eller lignende
• Pasteurpipette

Fremgangsmåde

• Fremstilling af løgekstraktet

1. Tilsæt 3 g NaCl til opvaskemidlet. Fyld op til 100 ml med destilleret vand.
2. Skær løget i små stykker, kantlængde ca. 5 mm. Hæld løgstykkerne i et bægerglas, og overhæld dem med vaskemiddel/saltopløsningen.
3. Rør i blandingen, og stil den i et 60 ºC varmt vandbad i præcis 15 min. Note: Denne behandling nedbryder cellemembranerne. Vaskemidlet danner komplekser med membranernes fedtstoffer (fosfolipider) og proteiner. Herefter vil fedtstofferne og proteinerne fælde ud af opløsningen. Na⁺-ionerne vil binde sig til DNA's negativt ladede fosfatgrupper. Ved 60 °C vil de evt. forekommende DNaser, der ellers kunne tænkes at nedbryde DNA, denaturere. Hvis man holder temperaturen på 60 ºC i længere tid, vil DNA nedbrydes.
4. Køl blandingen ned på et isbad i 5 min. Husk jævnligt at røre i blandingen. (Evt. 4a. Hæld blandingen i en blender, og kør i 5 sek. ved høj hastighed. Blendning nedbryder cellevægge og membraner yderligere, hvorved DNA frigøres. Note: Hvis man blender i længere tid, kan man risikere at ødelægge DNA-molekylerne).
5. Filtrer ned i et bægerglas gennem et kaffefilter. Undgå at få skum med ned i filtratet. Filtratet indeholder nu opløselige proteiner og DNA. Note: Filtratet kan eventuelt opbevares 1 - 2 døgn i køleskabet eller fryses ned.

Note: Et hurtigere alternativ til ovenstående, der også fungerer tilfredsstillende, er at blende løget sammen med vand, salt og opvaskemiddel og derefter filtrere løg-blandingen.

• Adskillelse af DNA fra løgekstraktet

1. (Evt. punkt 5a.) Hvis protease haves: Tilsæt 20 μl (et par dråber) proteinase K til 6 ml løgekstrakt i et reagensglas. Note: Enzymet vil nedbryde protein, der sidder bundet til DNAet.)
2. Fyld et højt glas (evt. reagensglas) halvt op med løgekstrakt, der evt. er blevet behandlet med protease (anbefalet omkring 6 ml løgekstrakt). Tilsæt samme volumen iskold 96 % ethanol. Hold glasset skråt og hæld forsigtig ethanolen ned langs glassets side. Ethanolen må ikke blandes med løgekstraktet, men skal lægge sig i et lag oven på. Lad glasset stå uforstyrret i 2-3 minutter. Note: DNA er uopløselig i iskold ethanol. Der vil fremkomme nogle bobler, mens de resterende proteiner opløses. DNA vil fælde ud i løgekstraktet og man vil se, hvordan DNA langsomt stiger op i alkoholen som en hvid tåge (ligner lidt bomuldsvat)
3. Nu kan man vikle DNA op på en glasspatel eller lignende ved forsigtigt at dreje spatlen rundt lige over grænselaget mellem løgekstrakt-vaskemiddel og alkohol - pas på ikke at føre glasspatlen ned i løgekstrakt-vaskemiddelblandingen. Vær meget forsigtig under opviklingen, ellers ødelægger man DNA-trådene. Overfør evt. DNA'et til et Eppendorfrør. Man kan også suge DNA op i en Pasteurpipette og genopløse det i en 4% NaCl-opløsning.

Flere muligheder:

1. DNA kan farves (f.eks m. acetoorcein eller Giemsa) og kan derefter mikroskoperes.
2. Man kan konstatere, at DNA er en syre ved hjælp af enten et pH meter eller med indikatorpapir.
3. Hvis man har genopløst DNA i 4% NaCl, kan man lave en gel-elektroforese på opløsningen. Man kan evt. skære det med nogle forskellige restriktionsenzymer.
4. I stedet for løg kan man f.eks. anvende kiwi, torskerogn, lever, kalvebrisler eller mikroorganismer. Man kan også lade eleverne arbejde med forskellige organismer og sammenligne resultaterne.

Vigtig note: Nucleinsyreopløsninger, der fremstilles på denne måde, er ikke særlig rene, man må forvente, at der specielt forekommer en del histoner i det. Metoden viser dog de væsentligste principper ved ekstraktion af DNA fra væv. Da der ikke arbejdes med levende organismer, er der ikke specielle regler for renhed og bortskaffelse af affald, der skal overholdes, man behøver f.eks. således ikke at arbejde sterilt.

Alternativer

I stedet for løg kan man f.eks. anvende torskerogn, lever, kalvebrisler eller mikroorganismer. Man kan også lade eleverne arbejde med forskellige organismer og sammenligne resultaterne.

Faremomenter

Det er et rimeligt fredeligt køkkenforsøg.

Faktorer

Et godt resultat opnås ofte først efter at have prøvet sig lidt frem - hvor lang tid man skal blende for at få tingene fordelt, men ikke DNAet ødelagt etc.

Perspektivering

Ved alle former for genteknologi, mikrobiologi og molekylær biologi anvendes oprensning af DNA til en lang række formål. Dette bør man nok uddybe med eksempler, hvis man vælger at lave dette forsøg for eksempelvis høj-niveau biologi (f.eks. oprensing af plasmider til kloning, kromosomalt DNA til RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analyse etc.). Til de fleste andre kan man nøjes med at sige at dette er DNA, som gør at vi alle sammen er forskellige, og at mennesker er forskellige fra dyr, dyr fra planter og også at ikke to mennesker er ens. Man kan evt. fortælle om sammenhængen mellem DNA og protein (Det Centrale Dogme; Det centrale dogme fortæller om informationsflowet i en celle; DNA aflæses til mRNA (messengerRNA) i cellekernen, der herefter transporteres ud i cellens cytoplasma, hvor det oversættes til protein.) Hvis man putter det rigtige stykke DNA ind i en løgets celler, kan man for eksempel få et løg til at udtrykke forskellige gener der kan få løget til f.eks. blive resistent overfor svampeangreb eller til at lave ekstra mange vitaminer. Hvis man vil have grønt fluorescerende løg, kan man indsætte genet (en DNA stump), der koder for GFP, Green Fluorescent Protein, i et løg. GFP stammer oprindeligt fra vandmanden Aequorea victoria, men anvendes i dag til monitorering af forskellige aktiviteter i den pågældende organisme, hvor det klones ind – og bruges altså ikke bare fordi det er sjovt at lave et grønt løg eller en grøn gris.

Andre beskrivelser

Websites med mere info:

- Kilden til forsøget.

- Om DNA

- Wikipedia om DNA, der er mest at læse i den engelske udgave.

- ”Oversæt” DNA til protein – desuden lidt information om Det Centrale Dogme mm.

- Figur der viser fremgangsmåden, se side 2 i dokumentet